پلیمر پلی ADP - ریبوز (PAR)

دسته: مقالات منتشر شده در 28 تیر 1400
نوشته شده توسط Admin بازدید: 993

پلیمر پلی ADP-ریبوز (PAR) بعنوان سیگنال مرگ

فعال شدن بیش از حد آنزیم هسته ای، پلی ADP- ریبوز پلیمراز  1- (PARP-1) نقش مهمی در آسیب های سلولی مختلف ایفا می کند. در اینجا، ما پلی ADP- ریبوز (PAR) را بعنوان یک سیگنال مرگ سلول که قبلآ مشخص نشده بود شناسایی می کنیم. پلیمر PAR مستقیمآ برای سلول های عصبی سمّی است و تخریب آن نیز با پلی ADP- ریبوز گلیکوهیدرولاز (PARG) یا فسفودی استراز 1 از مرگ سلولی ناشی از پلیمر PAR پیشگیری می کند. سمیّت تحریکیِ NMDA و وابسته به PARP در سلول های عصبی قشر مغز با خنثی سازی آنتی بادی ها به PAR و بیان بیش از حد PARG کاهش می یابد. کشت های عصبی با کاهش سطح PARG نسبت به کشت های WT، دارای حساسیت بیشتری به سمیّت تحریکی NMDA هستند. بیان بیش از حد PARG در موش های اصلاح شدۀ ژنتیکی بطور قابل توجهی حجم انفارکتوس را بعد از ایسکمی کانونی کاهش می دهد. برعکس، موش هایی که سطح PARG آنها کاهش یافته است، بطور چشمگیری حجم انفارکتوس را پس از ایسکمی کانونی درمقایسه با کنترل های گروه شاهد WT افزایش داده اند. این نتایج پلیمر PAR را بعنوان یک مولکول سیگنالینگ می دانند که باعث مرگ سلولی می شود و همچنین نشان می دهد که تداخل در سیگنالینگ این پلیمر ممکن است رویکردهای ابداعی در درمان را برای درمان آسیب های سلولی ارائه دهد.

 

پلی ADP- ریبوز پلیمراز1- (PARP-1) یک پروتئین کاملآ هسته ای است که در سیستم ترمیم برش پایه DNA نقش دارد؛ جایی که بطور بالقوه به وسیله جوش و پارگی فعال می شود. با استفاده از NDA بعنوان یک بستر، PARP-1 هموپلیمرهای واحدهای ریبوز ADP را بر روی پروتئین های مختلف هسته ای از جمله هیستون ها، پلیمرازهای DNA، توپوایزومرازها، لیگاز -2DNA، فاکتورهای رونویسی و خودِ PARP-1 ایجاد می کند. اگرچه عملکرد دقیق فیزیولوژیکی PARP-1 کاملآ درک نشده است، اما در بعضی از بافت ها نقش مهمی در ترمیم DNA و پایداری ژنومی ایفا می کند. کاتابولیسم پلی ADP-ریبوز (PAR) و متابولیسم فرایند دینامیک همراه با گلیکوهیدرولاز (PARG) هستند که در تخریب پلیمر نقش مهمی برعهده دارد. مطالعات اخیر با استفاده از مهار فارماکولوژیِ PARP یا KO ژنتیکی PARP-1 نشان می دهند که PARP-1 نقش مهمی در آسیب سلولی پس از سکته مغزی، تروما، ایسکمی-خونرسانی مجدد قلب، طحال، عضله اسکلتی و شبکیه، آرتریت، سمیّت سلولی بتا- ایزلت، متلیتوس دیابت، مدل -1 متیل -4- فنیل -1 ، 2، 3، 6 تتراهیدروپیریدین (MPTP) در بیماری پارکینسون، مدل آنسفالومیلیت خودایمن آزمایشی (EAE) در اسکلروزیس چندگانه، شوک اندوتوکسیک، نارسایی اندام چند سیستم و آسیب کبدی ایفا می کند. همچنین فعالسازی PARP-1 در سمیّت تحریک NMDA نقش مهمی دارد زیرا موش های KOPARP-1 بطور قابل توجهی به اثرات سمی تحریک کنندۀ گلوتامات و NMDA هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن مقاوم هستند. فرضیه خودکشی سلولی برای تفسیر اقدامات PARP-1 در واسطه مرگ سلول ارائه شده است. با این حال، مطالعات انجام شده روی موش های فاقد PARG نشان می دهد که پلیمر PAR که در طی فعالسازی PARP-1 تشکیل شده است، ممکن است در مرگ سلول وابسته به PARP-1 نقش داشته باشد. موش های KOPARG به دلیل عدم هیدرولیز پلیمر PAR و تجمع متعاقب آن در 3.5 روزه جنینی می میرند. علاوه براین، از دست دادن PARG در مگس سرکه نیز منجر به کشندگی در مرحله لارو در دمای رشد طبیعی (25 درجه سلسیوس) و تخریب عصبی پیشرونده با کاهش فعالیت حرکتی و طول عمر کوتاه در 29 درجه سلسیوس به دلیل تجمع پلیمر PAR می شود. در اینجا ما نقش پلیمر PAR را در مرگ سلول وابسته به PARP-1 بررسی می کنیم و همچنین بیان می کنیم که پلیمر PAR یک سیگنال مرگ سلولی محسوب می شود که نقش مهمی در مرگ سلول وابسته به PARP-1 دارد.

 

نتایج

سمیّت پلیمرPAR:

میزان بالایی از پلیمر PARP-1 تشکیل شده است و پس از آسیب های سمی مختلف که در آن فعالسازی PARP-1 نقش مهمی دارد، برای مدت طولانی بطور قابل توجهی افزایش می یابد. برای تعیین اینکه آیا پلیمر PAR برای القاء مرگ سلول های عصبی کافی است، توانایی زنده ماندن جنین با استفاده از پروپیدیم یدید (PI) و لکۀ فلورسنت بنز بنزیمید کنترل شد که آن هم ازطریق شمارش کمّی نورون های زنده و مرده به کمک رایانه پس از تحویل پلیمر PAR با واسطه BioPorter مشخص می شد. معرف BioPorter یک فرمول کاتیونی لیپیدی TFA-DODAP:DOPE است که امکان تحویل پروتئین های نوترکیب، پپتیدها یا آنتی بادی ها را به سلول های زنده فراهم می کند. پلیمر PAR با اصلاح خودکار آزمایشگاهی PARP-1 سنتز شد و دارای طول متوسط باقی ماندۀ 40 - ADP ریبوز است؛ همانطور که با روش های HPLC و الکتروفورز ژل تعیین می شود. بر همین اساس، غلظت PAR بعنوان تابعی از مولکول های پلیمر با طول متوسط 40 - ADP ریبوز مطرح می شود. اندازۀ PAR در این ترکیب 6 از    100متداول واحدهای 40 -ADP  ریبوز است. همچنین پلیمر PAR بطور اثربخشی با کمک معرف       BioPorter به سلول های عصبی قشر مغز منتقل می شود؛ همانطور که با استفاده از آنتی بادی پلیمر PAR و تصویربرداری کانفوکال مشخص می شود. علاوه براین، این پلیمر در اکثر سلول های عصبی مشاهده می شود. براساس شکل زیر، تحت این شرایط، پلیمر PAR باعث 50 درصد از مرگ های سلولی در سلول های عصبی قشر مغز می شود که با پیش تیمار پلیمر PAR با PARG یا فسفودی استراز 1 (PD1) که پلیمرهای PAR را تخریب می کند، از آن پیشگیری می شود.

 

شکل 1: مرگ سلولی به وجود آمده در سلول های عصبی به دلیل پلیمر PAR

 PAR polymer induces neuronal cell death

 

از آنجا که این پلیمر یک مولکول با بار منفی بالا است، همان غلظت پلی (آدنین) (پلی A ) که نیز دارای بار منفی است توسط BioPorter به سلول های عصبی قشر مغز اعمال می شود. تحویل پلی (A) با واسطه BioPorter منجر به مرگ سلول عصبی نمی شود. برای تعیین اینکه آیا پلیمر PAR در غیاب PARP-1 باعث مرگ سلولی می شود، برای کنترل مرگ سلولی به سلول های عصبی قشر مغز تحویل داده شد. در ادامه، تحویل این پلیمر نیز باعث مرگ سلولی در سلول های عصبی قشر مغز KOPARP-1 شد که با پیش تیمار با PARG کاهش یافت. این نتایج بدست آمده با هم نشان می دهند که پلیمر PAR سمّی بوده و میتواند بعنوان یک سیگنال مرگ در کشت های KOPARP-1 عمل کند.

 

پلیمرهای سمّی PAR با وزن مولکولی بالا:

این مطالعات اخیر با مخلوطی از پلیمرهای PAR با اندازه و پیچیدگی های مختلف انجام شده است. برای تعیین ماهیت این پلیمر که واسطۀ مرگ سلولی است، قابلیت پلیمرهای PAR تفکیک شده برای القای مرگ سلولی با استفاده از اندازه و پیچیدگی های مختلف در پلیمرهای PAR با طول 16 تا 60 باقی مانده ADP- ریبوز ارزیابی شد. براساس تعاریف کیلباچ و ژاکوبسن، از کسرهای DEANPR در این مطالعات استفاده شده است. افزایش طول و پیچیدگی پلیمرهای PAR منجر به افزایش مرگ سلولی می شود؛ در حالی که پلیمرهای پیچیده با واحدهای 60 ریبوز- ADP باعث 80 درصد مرگ سلولی در غلظت پلیمر 80 نانومتر می شوند. در غلظت پلیمر معادل، پلیمرهای دارای باقی ماندۀ 16ADP- ریبوز مرگ سلولی کمتری را ایجاد می کنند و پلیمرهایی با باقی ماندۀ 30 ریبوز-ADP  باعث مرگ سلولی متوسط می شوند. بنابراین، با سازگاری با تشکیل پلیمرهای پیچیده با وزن مولکولی بالا پس از مرگ سلول وابسته به PARP-1، پلیمرهای PAR دارای افزایش پیچیدگی و وزن مولکولی سمّی تر هستند. رابطه دوز- پاسخ در پلیمرهای پیچیده با 60 واحد ریبوز-ADP در مرگ سلول های عصبی قشر مغز انجام شد. غلظت های کم تا 20 نانومتر در پلیمر PAR باعث مرگ سلولی می شود و مرگ سلولی نیز همزمان با افزایش غلظت پلیمر PAR افزایش می یابد. این غلظت ها، طول و پیچیدگی پلیمرهای PAR در غلظت و اندازه های پلیمری موجود در سلول های سالم درطول سمیّت سلولی NMDA و سمیّت سلولی HeLa متیل نیترونیتروزوگوانیدین (MNMG) وابسته به PARP-1 قرار دادرند. بنابراین، این احمتال وجود دارد که پلیمرهای PAR با وزن مولکولی بالا تا حدی نقش PARP-1 را در مرگ سلول بازی کنند.

 

مرگ سلول ناشی از پلیمر PAR مستقل از کاسپاز:

مرگ سلول وابسته به PARP-1 تا حدودی مستقل از کاسپاز است. برای تعیین اینکه آیا مرگ سلول ناشی از پلیمر PAR مستقل از کاسپاز است یا نه، ما مرگ سلول در سلول های عصبی قشر مغز را پس از تحویل پلیمر PAR با واسطه BioPorter در حضور و عدم حضور مهارکنندۀ کاسپاز Z-VAD .fmk کنترل کردیم. Z-VAD قادر به پیشگیری از مرگ سلولی ناشی از پلیمر PAR نیست. همچنین پلیمرهای PAR قادر به فعالسازی مستقیم کاسپازها نیستند. برای اطمینان از اینکه آیا این یافته ها به سلول های غیرنورونی گسترش می یابند و آیا سیگنالینگ مرگ پلیمر PAR خارج از سیستم عصبی اتفاق می افتد، ما سمیّت PAR در سلول های HeLa را ارزیابی کردیم. پلیمرهای پیچیده و 60 واحد ریبوز-ADP  همانند نورون ها باعث مرگ سلولی می شوند؛ با 70 درصد مرگ سلولی در غلظت 80 نانومتری پلیمر PAR. علاوه براین، Z-VAD نمی تواند از مرگ سلولی ناشی از پلیمر PAR جلوگیری کند. با این حال، این نتایج بدست آمده نشان می دهند که این پلیمر باعث مرگ سلولی به روش وابسته به غلظت و مستقل از کاسپاز می شود.

 

مرگ سلولی وابسته به PARP-1 با واسطه پلیمر PAR:

برای تعیین نقش پلیمر PAR در سمیّت تحریکی NMDA بعنوان یک فرم مربوط به پاتوفیزیولوژیکی مربوط به مرگ سلولی وابسته به PARP-1، از آنتی سرم پلی کلونال خنثی کننده به پلیمر PAR استفاده شد. آنتی سرم آنتی PAR قادر به تخریب ایمنی پلیمر خالص PAR و سوپرناتانت هسته ای فعال شدۀ PARP-1 حاوی پلیمر درون زا PAR است؛ که به ترتیب با تحلیل لکه نقطه ای و تحلیل وسترن بلات ارزیابی می شود. این آنتی سرم قبل از تیمار NMDA با استفاده از معرف BioPorter به سلول های عصبی قشر مغز تحویل داده شد. با کمک این سیستم تحویل پروتئین، 95 درصد از سلول های عصبی آنتی سرم ضد par دریافت می کنند؛ همانطور که باوجود یک نشانگر فلورسنت نشان داده می شود که همزمان با آنتی سرم انجام شده است. تحویل این آنتی سرم با واسطه BioPorter باعث کاهش سمیّت تحریکی NMDA می شود، در حالی که انتقال غلظت معادل سرم قبل از ایمنی یا سرم خرگوش طبیعی با همین واسطه قادر به محافظت از سلول های عصبی در برابر مرگ سلولی ناشی از NMDA نیست. علاوه براین، ما یک آدنوویروس PARG جهش یافتۀ اگزون -1  حذف شده با کاتالیست غیرفعال ساختیم که در آن دو گلوتامات مهم در باقی مانده های 756 و 757 به آلانین ها جهش یافته اند. بیان بیش از حد آدنوویروس از WT و PARG جهش یافته با تحلیل وسترن بلات ارزیابی شد و ما افزایش چندین برابری در سطح WT و PARG حذف شدۀ - 1 جهش یافتۀ اگزون مشاهده کردیم. بیان بیش از حد آدنوویروس در PARG سیستولیک WT منجر به کاهش پلیمر سیستولیک PAR و همچنین کاهش 50 درصدی مرگ سلولی در سلول های عصبی ناشی از NMDA می شود؛ در حالی که بیان بیش از حد PARG جهش یافته با کاتالیست غیرفعال قادر به کاهش سطح پلیمر PAR سیستولیک و سمیّت NMDA نیست. برای کنترل اثرات جانبی بیان ژن با واسطۀ آدنوویروس، بیان بیش از حد GFP با واسطۀ آدنوویروس مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که هیچ تأثیری بر سمیّت تحریکی NMDA ندارد.