ژن رسانی پلیمری با سمیّت سلولی کم

ژن رسانی پلیمری با سمیّت سلولی کم ازطریق تعادل منحصر به فردِ انتهای زنجیرۀ جانبی

بیان پروتئین پس از تحویل DNA پلاسمید به هسته سلول به روند رونویسی و انتقال بستگی دارد. سیستم های انتقال دهندۀ ژن سیتوتوکسیک ممکن است این فرایندها را به خطر انداخته و بیان پروتئین را محدود کنند. این وضعیت شاید در سیستم های فعلی تحویل ژن پلی کاتیونی غیر ویروسی خیلی رایج باشد که در آنها ماهیت پلی کاتیونی در سیستم تحویل میتواند منجر به سمیّت سلولی شود. برای بررسی مسئلۀ ایجاد سیستم های انتقال ژن غیر سمّی اما اثربخش، فرض کردیم که انتقال مؤثر ژن با سمیّت سلولی کم میتواند ازطریق بهینه سازی تعادل بین تراکم کاتیونی پلیمر با ترکیبات فرّار اندوزومی ایجاد شود. بعنوان یک سیستم مدل، ما یک سری از پلیمرهایی را تولید کردیم که انتهای زنجیرۀ جانبی آنها باتوجه به تعادل مراکز کاتیونی و ترکیبات فرّار اندوزومی متفاوت بود. بویژه اینکه با آمیداسیون مشابه پلیمر، گروه های ایمیدازول را به آمین های ε-پلی لیسین در نسبت های مول متغیر (86.5, 82.5, 73.5 درصد مول ایمیدازول) متصل می کنیم. انتهای اولیۀ آمین های ε-پلی لیسین بعنوان مدلی برای مراکز کاتیونی عمل می کند؛ در حالی که گروه های ایمیدازول بعنوان مدلی برای گروه های فرّار اندوزومی عمل می کنند. این پلیمرها DNA پلاسمید را به نانو ساختارهای <150 نانومتر متراکم کرده و سمیّت سلولی کمتری در شرایط آزمایشگاهی دارند. کارآیی ترانسفکشن، همانطور که با بیان پروتئین لوسیفراز اندازه گیری میشود، با افزایش میزان ایمیدازول از پلیمرها در یک رابطۀ غیرخطی افزایش می یابد. پلیمری با بالاترین میزان ایمیدازول (86.5 درصد مول) در بالاترین بیان پروتئین با سطوحی برابر با واسطه های پلی اتیلنین اما با سمیّت سلولی کم وساطت کرد.

برای پیشبرد ژن درمانی در شرایط بالینی، سیستم های تحویل بهبودیافته یا ناقل ها بایستی DNA را به سلول تحویل دهند و همچنین تمام دستورالعمل های تنظیم کننده را برای استفادۀ ایمن در انسان اعمال کنند. ناقلین تحویل - ژن بطور معمول به دسته های ویروسی و غیرویروسی طبقه بندی میشوند که مزایا و معایب هرکدام به خوبی ثبت شده است. برای تحویل موفقیت آمیز DNA به هسته، ناقلین در هر دو دسته بایستی از چندین موانع فیزیکی و سلولی من جمله تراکم DNA در ساختارهایی با مقیاس نانومتر عبور کنند تا امکان داخلی سازی سلولی، فرار از تخریب DNA توسط هسته ها، محلی سازی درون هسته ای و جداسازی DNA از حامل فراهم شود. سیستم های تحویل - ژن که قادر به غلبه بر این موانع هستند، بدون ایجاد اثرات منفی بر روی ارگانیسم و سطح سلول میتوانند بطور بالقوه ناقلانی ایمن و مؤثر باشند. پلی کشی ها که بعنوان طبقۀ پیشرو در تحویل ژن غیر ویروسی محسوب میشوند، به دلیل تنوع مولکولی بالا میتوانند برای تنظیم دقیق خواص فیزیک و شیمیایی اصلاح شوند. همچنین مشخص شد که پلی کشی هایی همچون پلی لیسین ازطریق تعامل کولن میتوانند DNA  را به نانوساختارهای حلقوی متراکم کنند. اگر به درستی فرموله شود، شعاع ژیراسیون این مجموعه های DNA - پلی کشی 150 نانومتر است که بطور مؤثری میتواند بر اولین مانع در انتقال موفق ژن غلبه کند. تخریب نوکلئاز در محفظۀ لیزوزومی بعنوان دومین مانع در تحویل ژن مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته است.

پژوهش های مهمی در زمینۀ توسعۀ سیستم های انتقال ژن بر پایۀ پلی کشی (مانند مزدوج های پلی لیسین) با هدف به حداقل رساندن تخریب نوکلئاز ازطریق طراحی ناقل هایی با ظرفیت فرار از مسیر اندوزومی- لیزوزومی انجام شده است. بِهر و دیگران مفهوم "اسفنج پروتونی" را مطرح کرده و فرض کردند که پلیمرهایی با ظرفیت بافر بین 7.2 و5.0 مانند پلی اتیلن ایمین (PEI) و پلیمرهای حاوی ایمیدازول میتوانند اندوزوم را بافر کرده و بطور بالقوه پارگی آن را القا کنند. سطوح بیان پروتئین با واسطه پلیمر پروتون- اسفنج پلی کاتیونی به تنهایی حداقل 10 برابر بیشتر از پلی لیسین بود. با این حال، یکی از معایب PEI سمیّت سلولی ذاتی آن است. اگر چه پلیمرهایی با تراکم کاتیونی بالا DNA را به ساختارهایی با قابلیت درونی سازی سلولی ازطریق اندوسیتوز متراکم می کنند، اما تراکم بالای بار نیز یکی از عوامل مؤثر بر سمیّت سلولی آنها است. ازطرف دیگر، چگالی بار کاتیونی کم میتوان قابلیت تراکم را کاهش داده و یا از بین ببرد. تعادل بین چگالی کاتیونی و چگالش DNA پیچیده تر میشود در صورتی که مزدوج با بخش های فرّار اندوزومی در نظر گرفته شود. این سؤال برای ما مطرح شد که آیا بهینه سازی تعادل بین بخش های شارژ شده و فرّار از اندوزوم میتواند بعنوان مبنایی برای طراحی منطقی و به دنبال آن سنتز سیستم تحویل- ژن پلی کاتیونی با سمیّت سلولی کم، قابلیت چگالش DNA و پتانسیل فرّار اندوزومی باشد؟ در اینجا، مدل تحویل ژن پلی کاتیونی را برای ارزیابی این فرضیه مورد بحث قرار می دهیم.

فرایندهای تجربی

پلی لیسین(Mr=34.300,lot#4745546)،-3 (دیم اتیل تیازول -2)-2، 5- دیفنیل تترازولیوم برومید (MATT) و MES از شرکت سیگما؛ ان هیدروکسی سوسینیامید، -1اتیل-3 (دی متیل آمینوپروپیل) کربودیمید، نمک دی هیدرات سدیم اسید 4- ایمیدازولیستیک و  PEIاز شرکت آلدریچ خریداری شده و سپس بدون تصفیۀ بیشتر مورد استفاده قرار گرفتند.  HepG2 هپاتوبلاستوما و خطوط عضلانی صاف CRL1476 از مجموعه کشت نوع آمریکایی خریداری شده و سپس مطابق با پروتکل های ATCC کشت شدند. تمام پلاسمیدهای مورد استفاده نیز حاوی بیش از 90 درصد DNA فوق پیچیده بودند.

سنتز مزدوج پلیمر:

اسید پلی لیسین - گرفت ایمیدازولاستیک با استفاده از آمینۀ ε -پلی لیسین با اسید ایمیدازولاستیک-4 و همچنین سیستم تراکم 1- اتیل3-(3-دی متیل آمین اپروپیل) کربودی آمید MES هیدروکسی ساسینیامید (NHS) سنتز شد. روش کلی سینتیک کمتر از 75 مول درصد در پلیمر جایگزین توصیف شده است و این روش به راحتی برای سایر درصدهای جایگزینی ایمیدازول مطابقت داشت. در دمای اتاق و در لولۀ 15 مول پلی پروپیلن، 200 میلی گرم پلی لیسین به 4 میلی لیتر بافر(EDAC)25 میلی مولار حل شد که 75 مول درصد اسید -4 ایمیدازولاستیک نیز اضافه شد. از این محلول برای حل EDAC استفاده شد. همچنین NHS در 2 میلی لیتر بافرMES  حل شده و سپس بلافاصله به محلول پلی لیسین افزوده شد. لوله واکنش به مدت 24 ساعت در دمای اتاق سربسته و وارونه قرار داده شد و سپس، محلول به یک واحد فیلتراسیون سنتریپر (قطع وزن مولکولی 10.000) اضافه شد. واحدهای سنتریپر در 4500دور در دقیقه برای جدا سازی پلیمر از اجزای مولکولی کم وزن سانتریفیوژ شدند. پس از هر سانترفیوژ، آب مقطر به محلول پلیمر اضافه شد. این فرایند سانتریفیوژ و رقت کسری پلیمر در کل 10 بار تکرار شد و پس از آن، محلول پلیمر منجمد شد و درنهایت آب با لیوفیلیزاسیون خارج شد.

خواص:

محتوای ایمیدازول در هر پلیمر سنتز شده ازطریق کمّی سازی آمین های آزاد باقی مانده بر روی پلیمر با استفاده از روش نین هیدرین به خوبی مشخص شده و به دنبال آن، تفریق سیگنال آمین تعیین شد.

سنجش تأخیر در ژل:

کمپلکس های پلیمر DNA با مخلوط کردن 50 میلی لیتر DNA پلاسمید به 50 میلی لیتر محلول پلیمر حاوی مقادیر مختلف پلیمری تشکیل شدند؛ به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند و پس از آن، 20 میلی لیتر از آن با 1 درصد گاروسژل ترکیب شد. باندها نیز با برومید- اتیدیوم رنگ آمیزی شدند.

اندازۀ مجموعه و اندازه گیری پتانسیل زتا:

مجموعه های پلیمر- DNA با افزودن 50 میلی لیتر DNA پلاسمید به 50 میلی لیتر محلول پلیمر گرداب حاوی مقادیر مختلف پلیمر در لوله های 1.5 میلی لیتری اپندروف تشکیل شدند؛ سپس 15 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند و پس از آن، با بافر هپس فیلتر شده به 1 میلی لیتر رقیق شدند. اندازه و پتانسیل های زا در این مجموعه ها با استفاده از شفاف سازی پراکندگی نور- دینامیکZetaPALS  با لیزر 15 میلی وات و پرتو لیزر 676 نانومتر در 25 درجه سانتیگراد اندازه گیری شد. عملکردهای هماهنگ در زاویۀ پراکندگی 90 درجه جمع آوری شدند و اندازۀ ذرات نیز با استفاده از آپشن اندازه گیری چند ضلعی در نرم افزار اندازه گیری ذرات محاسبه شد. اندازه ذرات با فرض توزیع غیرطبیعی بعنوان قطرهای مؤثر بیان میشود. درنهایت، پتانسیل های زتا نیز با استفاده از مدل  Smoluchowsky محاسبه شدند.

سنجش سمیّت سلولی:

سمیّت سلولی با استفاده از هر دو روش MTT و شمارش کلی سلول مورد بررسی قرار گرفت. سلول ها در صفحات 96 حفره ای با تراکم اولیه 10000 هزار سلول در هر حفره در 0.2 میلی لیتر محیط رشد به مدت 24 ساعت کشت شدند؛ پس از آن، محیط رشد به 0.18 میلی لیتر OPTI-MEMI رسید. سپس پلیمر در 20 میلی لیتر بافر هپس به سلول ها اضافه شد (هپس بدون پلیمر برای کنترل حفره ها افزوده شد). پس از انکوباسیون 4 ساعته در دمای 37 درجه سانتیگراد، محیط حاوی پلیمر برداشته شده و با محیط کار جایگزین شد. فعالیت متابولیکی  سلول ها 24 ساعت بعد با استفاده از MTT  اندازه گیری شد.

آزمایشات ترانسفکشن:

سلول ها در صفحات 6 حفره ایی با تراکم اولیه 13105 تا 33105  سلول در هر حفره در 2 میلی لیتر محیط رشد در زمان ترانسفکشن به 60-70  درصد رسیدند؛ که 24 ساعت پس از پلاتینه شدن بود. مجموعه های پلیمر DNA با افزودن 50 میلی لیتر DNA به 50 میلی لیتر پلیمر در هنگام ورتکس کردن تشکیل شدند. هر نمونه از این کمپلکس حاوی 10 میلی گرم DNA بود و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد تا کمپلکس بطور کامل تشکیل شود. محیط رشد سلول قبل از افزودن کمپلکس حذف شده و با POTI-MEMI جایگزین شد. پس از انکوباسیون، سلول ها همراه با کمپلکس ها به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و درجه رطوبت 5 درصدی در محیط حاوی دی اکسیدکربن قرار گرفتند، سپس محیط حاوی کمپلکس حذف شده و با 2 میلی لیتر از محیط رشد جایگزین شد. بعد از 24 ساعت، محلول های سلول تشکیل شده و ازلحاظ فعالیت لوسیفراز و محتوای پروتئین کل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

نتایج

سنتز پلیمر:

مزدوج های پلی لیسین- گرفت - ایمیدازولاستیک اسید جایگزین شده با گروه های ایمیدازول در سه درصد مختلف مول (75، 85 و 95 درصد مول) برای ایجاد نگرشی از تأثیر احتمالی نسبت آمینیمیدازول بر روی تراکم DNA ، سمیّت سلولی و کارایی ترانسفکشن سنتز شدند. پلیمرهای "1، 2 و 3" به ترتیب حاوی 73.5، 82.5 و 86.5 درصد مول جایگزین ایمیدازول تعیین شدند. هر آمیداسیون بطور مؤثر یک "آمین لیسین" را با یک گروه عملکردی ایمیدازول جایگزین می کند؛ در نتیجه، علاوه بر کاهش کلی تراکم کاتیونیِ زنجیرۀ پلیمری درpH 7.2، به تصادفی شدن بارهای کاتیونی در پلیمر منجر میشود. این جایگزینی آمین لیسین با عملکرد ایمیدازول اتفاق می افتد که به تعیین روابط عملکرد ساختاری موجود در سیستم کمک می کند.

خواص کمپلکس های پلیمر DNA

از اهمیت اولیه این بود که مشخص شود آیا مزدوج های حاوی ایمیدازول می توانند با DNA پلاسمید بطور الکترواستاتیکی کمپلکس شوند یا خیر. کاهش چگالی پلی کاتیونی ممکن است ظرفیت چگالی DNA پلیمر را کاهش دهد. همچنین گزارشاتی از تحویل آن با پلی لیسین نشان می دهد که با کاهش درجه پلیمریزاسیون، کارایی انتقال نیز کاهش می یابد. از طرف دیگر، برخی از محققان نشان داده اند که پلی لیسین با وزن مولکولی پایین میتواند DNA را به کمپلکس های کوچک متراکم کند؛ در حالی که برخی دیگر فعالیت رونویسی آن را با کاهش وزن مولکولی پلی لیسین بیان کرده اند. با وجود این گزارشات تا حدودی متفاوت در مقالات، میتوان گفت که پیش بینی فعل و انفعالات بیوفیزیکی بین DNA و پلیمرهای حاوی ایمیدازول بویژه باتوجه به تراکم DNA بسیار دشوار بود. برهمکنش الکترو-استاتیک بین  پلاسمید و پلیمرها بعنوان تابعی از محتوای پلیمر ایمیدازول و DNA را بعنوان خواص اولیه کمپلکس ها بایستی در نظر گرفت: نسبت پلیمر با تأخیر الکتروفورتیک ژل تعیین شد. علاوه براین، روند کمپلکس های پتانسیل زتا منفی که در ابتدا با افزایش محتوای پلی کشی بار مثبت میشوند، برای کمپلکس های پلی کشی DNA نرمال است.

سمیّت سلولی

سمیّت سلولی آزمایشگاهی پلیمرهای پلی لیسین- گرافت- ایمیدازولاستیک اسید بعنوان تابعی از غلظت پلیمر با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. نتایج حاصل از رده سلولی اراده شده در شکل زیر نشان می دهد که سمیّت سلولی هم برای پلی لیسین و هم برای PEI با افزایش غلظت پلیمر افزایش می یابد؛ با بیش از نیمی از سلول های متابولیک در بالاترین غلظت پلیمر که غیرفعال هستند.

فعالیت متابولیک آزمایشگاهی  سلولهای عضلانی صاف بعنوان تابعی از غلظت پلیمر CRL

نتایج بدست آمده در تمام رده های سلولی آزمایش شده سازگار است. از آنجا که روش MTT تنها سنجشی از فعالیت متابولیک سلولی است، آزمایشات سمیّت سلولی مشابهی برای تعیین زنده ماندن سلول با تحلیل مستقیم شمارش سلول انجام شد. علاوه براین، داده های بدست آمده با استفاده از روش MTT ارتباط مستقیمی با داده های بدست آمده از تجزیه و تحلیل شمارش سلولی دارند.